AG视讯-凤凰AG全讯网及时

暨南大學(xué)融媒體中心訊 近日，暨南大學(xué)中藥生物技術(shù)研究所朱建華教授和于榮敏教授團(tuán)隊(duì)在nature commnications期刊發(fā)表題目為“Dihydroartemisinic acid dehydrogenase-mediated alternative route for artemisinin biosynthesis”的研究成果。該研究首次報(bào)道了一種來(lái)自黃花蒿的二氫青蒿酸脫氫酶（Dihydroartemisinic acid dehydrogenase,AaDHAADH），AaDHAADH能夠催化AA和DHAA之間的雙向轉(zhuǎn)化。研究團(tuán)隊(duì)通過定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得了該酶的定向優(yōu)化突變體（活性提高2.82倍），實(shí)現(xiàn)了AA到DHAA的高效轉(zhuǎn)化，并且在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了DHAA的從頭合成，通過補(bǔ)料分批發(fā)酵在5 L生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了3.97 g/L的DHAA產(chǎn)量。為ART的生物合成提供了一條更加便捷、高效的生產(chǎn)途徑。

論文封面

背景介紹：

2006年，D.K.Ro等人首次實(shí)現(xiàn)工程化酵母菌株發(fā)酵生產(chǎn)青蒿酸（Artemisinic acid,AA）——抗瘧疾藥物青蒿素（Artemisinin,ART）的前體化合物，開啟了采用合成生物學(xué)方法生產(chǎn)青蒿素類化合物（Artemisinins,ARTs）的新篇章。

2013年，C.J.Paddon等人通過對(duì)ART生物合成進(jìn)行工程化改造和定向整合，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量AA的生產(chǎn)（25 g/L，5 L發(fā)酵罐）。隨后他們通過AA化學(xué)合成二氫青蒿酸（Dihydroartemisinic acid,DHAA），再經(jīng)DHAA自動(dòng)氧化實(shí)現(xiàn)半合成法生產(chǎn)ART。但化學(xué)合成和多步自動(dòng)氧化步驟仍面臨產(chǎn)量損失，成本過高等問題，導(dǎo)致目前ART的市場(chǎng)來(lái)源仍然主要依賴于直接從黃花蒿植株中提取獲得。

在ART的生物合成途徑中，AA經(jīng)DHAA轉(zhuǎn)化為ART是目前最優(yōu)的路徑（Km,ALDH1 to AO，.58 μM,Km+EDBR2 to AO+E9 μM，代謝流傾向于生成AA），而催化AA生物合成DHAA的關(guān)鍵酶一直未被發(fā)現(xiàn)（圖1）。

圖1 ART的生物合成途徑線路圖

研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介：

關(guān)鍵酶的挖掘和功能驗(yàn)證：

本研究創(chuàng)新性地采用以活性導(dǎo)向的蛋白純化、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)相結(jié)合的策略，成功地從復(fù)雜的植物粗酶體系中富集到目標(biāo)酶，為鑒定低豐度酶和闡明未知中間產(chǎn)物的天然產(chǎn)物生物合成途徑提供了新思路。

本研究在酶功能驗(yàn)證中不僅建立異源表達(dá)體系（大腸桿菌和本氏煙草），還將候選基因在內(nèi)源宿主（黃花蒿細(xì)胞）中進(jìn)行功能驗(yàn)證，該方法更接近酶的天然催化環(huán)境，可以真實(shí)反映其生理作用，彌補(bǔ)了異源表達(dá)系統(tǒng)的不足。同時(shí)，過表達(dá)和RNAi干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步確證了AaDHAADH在催化AA/DHAA轉(zhuǎn)化和ART生物合成中的關(guān)鍵作用（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)基因黃花蒿細(xì)胞系中AaDHAADH的相對(duì)表達(dá)情況及化合物AA、DHAA和ART的含量變化。

在釀酒酵母中從頭合成DHAA：

為了實(shí)現(xiàn)DHAA的發(fā)酵生產(chǎn)，作者通過對(duì)MVA途徑（ERG10、ERG19、IDI1、tHMG1和ERG20）和ART下游生物合成途徑中的關(guān)鍵基因（ADS、CYP71AV1、CPR、ALDH1、ADH1、CYB5和AaDHAADH(P26L)）進(jìn)行定向整合，得到高產(chǎn)DHAA的釀酒酵母底盤菌株（菌株DHAA-2）。菌株DHAA-2在250 mL搖瓶中的發(fā)酵產(chǎn)量為0.35 g/L，采用5 L生物反應(yīng)器對(duì)菌株DHAA-2進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，在216 h時(shí)DHAA的產(chǎn)量達(dá)到3.97 g/L（圖3）。AaDHAADH的發(fā)現(xiàn)，為半合成法生產(chǎn)ART提供了一條更加經(jīng)濟(jì)、高效的DHAA來(lái)源途徑。

圖3 釀酒酵母中DHAA的代謝工程

A:ART生物合成途徑關(guān)鍵基因的整合；B：搖瓶發(fā)酵中AA與DHAA的產(chǎn)量（a:tHMG1+ERG10+ERG19+IDI1+ERG20+ADS+CYP71AV1；b:CPR+ALDH1；c:CYB5+ADH1；d:AaDHAADH（P26L）；e:PTHI2）；C：菌株DHAA-2與AA-3的搖瓶發(fā)酵與5 L生物反應(yīng)器發(fā)酵的產(chǎn)量；D：菌株DHAA-2在5 L生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)及產(chǎn)量。

在本氏煙草中重構(gòu)ART的生物合成途徑：

基于DHAA可以自動(dòng)氧化生成ART的特性，作者通過瞬時(shí)表達(dá)ART生物合成途徑中的關(guān)鍵基因（tHMG1、ERG20、ADS、CYP71AV1、CPR、CYB5、ADH1、ALDH1和AaDHAADH(P26L)），在本氏煙草中重構(gòu)ART的生物合成途徑（圖4-A）。通過在本氏煙草中共表達(dá)ADS、CYP71AV1和CPR，發(fā)現(xiàn)AA的產(chǎn)量為0.28 mg/g DW（圖4-B,D）。當(dāng)引入ADH1、ALDH1和CYB5后，AA產(chǎn)量提升至0.62 mg/g DW（圖4-B,D）。進(jìn)一步通過添加MVA途徑的關(guān)鍵基因tHMG1和ERG20優(yōu)化瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，成功將AA產(chǎn)量提高至1.19 mg/g DW（圖4-B,D）。加入定向優(yōu)化的活性酶AaDHAADH(P26L）后，DHAA產(chǎn)量達(dá)到0.51 mg/g DW（圖4-C,D），但在瞬時(shí)表達(dá)的本氏煙草中未檢測(cè)到ART。為加速DHAA自動(dòng)氧化生成ART，作者對(duì)本氏煙草葉片進(jìn)行紫外線照射處理，最終檢測(cè)到ART產(chǎn)量為0.041 mg/g DW（圖4-C,D）。

利用本氏煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)重構(gòu)AA/DHAA/ART生物合成途徑，不僅證實(shí)了 AaDHAADH在異源植物體內(nèi)的催化功能，也為后續(xù)工程化植物合成ART積累了重要的元件和思路，對(duì)探索ART轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、提高植物合成效率具有重要意義。同時(shí)，這一研究也揭示了DHAA經(jīng)自動(dòng)氧化生成ART的化學(xué)轉(zhuǎn)化機(jī)制，進(jìn)一步佐證了DHAA是ART生物合成的直接前體。

圖4 在本氏煙草中重構(gòu)ART的生物合成途徑

A：在本氏煙草中ART的生物合成線路圖；B：在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)關(guān)鍵酶生產(chǎn)AA的LC-MS檢測(cè)（m/z=233.2）；C：在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)關(guān)鍵酶生產(chǎn)DHAA(m/z=235.2）和ART(m/z=283.1）的LC-MS檢測(cè)；D：不同基因組合侵染處理的煙草葉片中產(chǎn)物AA、DHAA和ART的含量。

結(jié)論：

本研究在ART生物合成中成功鑒定獲得活性酶AaDHAADH，填補(bǔ)了AA生物合成DHAA關(guān)鍵酶的空白。同時(shí)，本研究在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了DHAA的從頭合成，在5 L生物反應(yīng)器中的產(chǎn)量達(dá)到3.97 g/L，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。此外，本研究在本氏煙草中重構(gòu)了ART的生物合成途徑，進(jìn)一步驗(yàn)證了AaDHAADH在植物體內(nèi)的催化功能，也為ART的工程化植物合成提供了新的元件和思路。

論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-59312-1

責(zé)編：周會(huì)謙